CENTRO DE BACHILLERATOS TECNOLOGICO INDUSTRIAL Y DE SERVICIOS
No. 199
“PROCESAR CULTIVOS BACTERIOLOGICOS”
Practica No. 6
Profesor: Vicente Martínez Fragoso.
Alumna: Majettzi Gómez Hernández.
Equipo: 5
Semestre:
2012-2012
“Preparación, Fijación Y Coloración Simple ”
Objetivos:
Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de frotis, de fijación y coloración más utilizadas en el estudio microscópico de cultivos bacterianos, obtenidos de medios sólidos y líquidos. Que identifique las principales formas bacterianas y la importancia de las tinciones simples en la caracterización morfológica de estos microorganismos.
Introducción: .
Debido al pequeño tamaño de la mayoría de los microorganismos, se requiere de un microscopio óptico, ya sea de campo claro o de 'campo oscuro para hacer la descripción morfológica de, éstos. El microscopio de uso más comúñ es el de campo claro, en el que la observación dé células vivas es limitada debido a que las células son incoloras y permiten el paso de una gran cantidad de luz.
La observación de frotis teñidos es, más recomendable. El frotis se prepara haciendo una extensión de los microorganismos sobre una superficie transparente, en la cuál se fijan y se tiñen los microorganismos. De acuerdo al número de soluciones colorantes y a los objetivos de estudio se pueden realizar diferentes tipos de Unciones como son: simple, diferencial, negativa y selectiva.
Los frotis.de cultivos líquidos se deberán fijar con alcohol para evitar residuos del medio, que al quemarse darán interferencias en las observaciones y los de 'colonias de medios sólidos se fijan generalmente con calor. Después de la fijación, los frotis son teñidos con diferentes colorantes sintéticos derivados de anilina.
Los colorantes mas utilizados son sales formadas por iones coloridos cargados conocidos como cromóforos. Por ejemplo:
Cloruro de azul de metileno - Azul de metileno + CI (Cromóforo)
Si el cromóforo es un ion positivo el colorante es de tipo básico, pero si la carga es negativa será de tipo ácido. La 'mayoría de las bacterias son teñidas por colorantes básicos; que permean la pared celular y se adhieren por enlaces jónicos débiles a moléculas con cargas negativas de la célula bacterianas. La tinción de las' bacterias con azul de metileno, es un ejemplo de Unción simple que facilita la observación de forma, tamaño y arreglo de las células.
Material | Reactivos |
· Probeta de 100 ml | · Azul de metileno |
· Vaso de precipitado de 100 ml | · Fenol |
· Mechero | · Aceite de inmersión |
· Asa de siembra | · |
· 5 porta objetos | |
· Piseta | |
· Microscopio |
Procedimiento:
El profesor proporcionará a los y alumnos, cultivos líquidos cultivos y solidos de: Escherichia coli, Streptococcus staphylococcus, Bacillus subtilis, Klebsiella y Pseudomonas fluorescens. El estudiante preparará frotis de cada. cepa obtenida de cultivo sólido y otros de cultivo liquido, los cuales fijará y teñirá con azul de metileno.
El profesor explicará los principios de manejo del microscopio y la forma de ajustar la iluminación.
Preparación De Frotis
1. Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos.
2. Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo.
3. Dejar enfriar el ase para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos. Después acercar al mechero el tubo de cultivo, quitarle el tapón y flamear rápidamente la boca del mismo, introducir el asa en el tubo de cultivo y tomar cuidadosamente la muestra.
4. Para el caso de cultivos líquidos, colocar la muestra en el centro del portaobjetos extender suavemente en un área. circular de 2 cm de diametro aproximadamente y esterilizar nuevamente el asa. Dejar secar el frotis al aire y repetir el procedimiento 3 y4 por 2-3 veces más.
5. Si el cultivo es de medio sólido, previamente se colocará en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada en la que sé mezcla una pequeña muestra. del cultivo que se toma siguiendo las indicaciones del paso 3, extenderla suavemente y dejarla secar al aire.
Fijación de frotis
a) Fijar los frotis de cultivos líquidos con dos gotas de metano¡ o etanol absoluto y dejar secar al aire (hacer esto en zonas alejadas del mechero)
b) Los frotis. de cultivos sólidos, completamente secos se fijarán con calor. Para esto se pasará el frotis rápidamente 2-3 veces en el interior de la parte amarilla de la flama del mechero. .
c) Palpar la parte inferior del portaobjetos con el dorso de la mano izquierda para enfriar y comprobar que no hubo sobrecalentamiento. . .
Tinción Simple
§ Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto.
§ Eliminar el exceso de colorante con lavado suave al agua corriente o con la ayuda de la piseta con agua
§ Dejar secar al aire.
Observación Al Microscopio
a) Limpiar cuidadosamente los objetivo y el ocular del microscopio con papel seda.
b) Ajustar la luz en el centro del campo de observación, siguiendo las indicaciones del profesor.
c) Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparación con el objetivo de 10x, posteriormente pasar al de 40x Para la observación con el objetivo de l00x, colocar previamente una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación.
d) Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel - seda para eliminar el exceso de aceite y evitar incrustaciones que dañan estos sistemas.
Observaciones:
Cultivo solido
Tinción simple tinción de gram -
Resultados:
Cultivo solido | Tinción simple | Tinción de gram |
Forma | Cocos | Cocos |
Agrupación | estafilococo | Estafiiococo |
Al ser gram negativo y que la muestra fue un exudado vaginal se llega a la conclusión de de que podría ser garnelera vaginalis hemolítica ya que había sido sembrada en una agar sangre
Conclusión:
Se realiza la preparación de un frotis el cual se deberá teñir con diversos colorantes o solo hacer una tinción simple haciendo uso de los pasos antes descritos para poder observar los microorganismos patógenos que aquejan a los pacientes.
FUENTES DE INFORMACION:
Fue consultada el dia: 11 de marzo.
